網赤血球の成熟過程 － 貧血マウスを用いたRET チャンネルの実験的検証 －

• 網赤血球の成熟過程 － 貧血マウスを用いたRET チャンネルの実験的検証 －

著者

河野 麻理, 高木 由里, 近藤 民章, 藤本 敬二

シスメックス株式会社 学術本部 セルアナリシスセンター

Summary

RETチャンネルとは，シスメックス社製の多項目自動血球分析装置XT-2000i ，XE-2100 およびXE-5000 などに搭載されている網赤血球測定機能である. 網赤血球の残存RNAを，蛍光色素を含む染色試薬RETSEARCHⅡで染色し，その蛍光強度によりLFR ( Low-Fluorescence Ratio )，MFR
( Middle-Fluorescence Ratio )，HFR ( High-Fluorescence Ratio ) の３分画に分けて網赤血球をカウントしている. RETチャンネルのカウント値は赤血球新生の状態把握や，貧血や骨髄抑制などの診断に広く利用されている. LFR，MFR，HFRそれぞれに分画される細胞は，初期の未成熟な網赤血球( HFR ) から，最も成熟に近い網赤血球( LFR ) へと，異なる成熟ステージを反映していると言われているが，これまでに各分画の細胞について特徴づけを行った報告はない.

今回我々は，異なる成熟ステージの細胞について特徴づけを行うことを目的とし，形態およびRETSEARCHⅡ染色パターンについて解析を行った. さらに，それぞれのRETSEARCHⅡ染色パターンについて，よく知られている網赤血球の表面マーカーCD71 抗原( トランスフェリン受容体 ) の発現パターン，およびニューメチレンブルー染色パターンとの比較を行った.

フェニルヒドラジンを腹腔内投与して５日目の貧血誘導マウスの血液を用い，セルソーティングシステムによりRETチャンネルスキャッタグラムを再現し，LFR，MFR，HFRそれぞれの分画の細胞をソーティング後，固定し，透過型電子顕微鏡( TEM ) で観察を行った。さらに同様の血液について，RETSEARCHⅡとCD71-Alexa488 の二重染色後，FACSで解析を行う一方，共焦点レーザー顕微鏡( CLMS ) での観察を行った.

TEMとCLMSの解析から，CD71 抗原の発現消失の様子，および残存オルガネラなどの内部構造がHFRからLFR，成熟赤血球RBC ( Red Blood Cell ) へと成熟が進むにつれて消失していく様子が観察できた. また，FACS解析から，CD71 の発現がより幼若な細胞に分布していて，HFRからMFRの間で急速に消失することがわかった. 同様の結果がコロイド金標識CD71 抗体を用いた免疫電子顕微鏡法でも確認できた.

特記すべきことは，TEMにより，全ての未成熟細胞分画( LFR，MFR，HFR ) で残存リボソームが確認できた一方，成熟赤血球分画RBCでは観察されなかったことである. 網赤血球解析の標準法であるニューメチレンブルーによる超生体染色では，残存リボソームが染色され，この有無によって網赤血球の判定を行っている. このことから，RETチャンネルによる網赤血球判定が，ニューメチレンブルー超生体染色による判定と形態的に一致することが証明できた.

さらに，本検証は，網赤血球の成熟過程に関する多数のin vitro の報告に対し，非常に稀なin vivo での解析報告であるが，得られた結果はこれまでのin vitro の検証を裏付けるものであった.

Key Words

RETチャンネル, 網赤血球, 成熟，CD71 ( トランスフェリン受容体 ), 形態